Małgorzata Bajor, Monika Bijata, Ireneusz Biedermann, Janusz Blaszczyk, Małgorzata Bonus, Mayank Chaturvedi, Daniel Dętka, Stefan Dowgird, Magdalena Dziembowska, Adam Filip, Magdalena Gacia, Dorota Gierej, Tomasz Górkiewicz, Katarzyna Grab, Piotr Jahołkowski, Dariusz Jaskulski, Katarzyna Janczak, Anna Kiryk, Danylo Khomiak, Agnieszka Kurczuk, Tomasz Lebitko, Wiktoria Lioudyno, Katarzyna Łepeta, Olga Markina, Jarosław Mazuryk , Jacek Miłek, Evgeni Nikolajew, Małgorzata Oglecka, Rafał Płatek, Alicja Puścian, Piotr Rogujski, Izabela Rutkowska-Włodarczyk, Marcin Rylski, Ahmad Salamian, Jolanta Sierocińska, Magda Szymańska, Krystyna Tabeńska, Marta Tkaczyk, Robert Tomaszewski, Anna Soltynska-Urbanska-Trauzold, Behnam Vafadari, Grzegorz Wilczyński, Jakub Włodarczyk, Grażyna Woźniak, Katarzyna Żybura
Zmiany siły połączeń pomiędzy komórkami nerwowymi są podstawą zdolności adaptacyjnej mózgu do zmieniających się warunków otoczenia, np. w zjawiskach uczenia się i pamięci. Podłożem tych zmian jest tzw. plastyczność synaptyczna. Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za zmiany plastyczne synaps pobudzających, które ulokowane są na komórkach nerwowych na tzw. kolcach dendrytycznych, są jeszcze słabo poznane i stanowią pole bardzo intensywnych badań. Zrozumienie tych mechanizmów ma z oczywistych powodów podstawowe znaczenia dla poznania funkcjonowania mózgu, a w szczególności relacji mózg-umysł, w warunkach fizjologicznych, w tym i takich zjawiskach, jak uczenie się i pamięć. Równocześnie poznanie mechanizmów plastyczności synaptycznej uważane jest za klucz do zrozumienia istoty najpoważniejszych chorób mózgu. Trzeba tu nadmienić, że badania genetyczne u ludzi pokazały znaczenie polimorfizmów i mutacji w genach kodujących białka synaps pobudzających i kolców dendrytycznych dla rozwoju chorób psychicznych. Warte szczególnego podkreślenia są w tym kontekście olbrzymie koszty społeczne i finansowe – ocenia się, że w krajach Unii Europejskiej te drugie wynoszą 800 mld euro rocznie, w tym 500 mld euro pochłaniają choroby psychiczne. Zainicjowane przez nas 15 lat temu badania nad zewnątrzkomórkowym enzymem proteolitycznym – MMP-9 pokazały, że może on odgrywać znaczącą rolę w zjawiskach plastyczności synaptycznej. Podejrzewamy, że dzieje się tak w wyniku udziału MMP-9 w kontroli przebudowy kolców dendrytycznych. Celem niniejszego projektu jest weryfikacja tej hipotezy. Badania będą prowadzone na hodowlach neuronalnych, w których pojedyncze synapsy zostaną pobudzone poprzez lokalne uwolnienie neuroprzekaźnika – glutaminianu. Planujemy zbadać, w jakich warunkach i na jakich kolcach (które mogą mieć różny kształt i wielkość, co ma związek z ich funkcją) MMP-9 jest wydzielane i może wykazywać swoją aktywność. Postulujemy bezpośredni związek pomiędzy MMP-9 i dobrze już poznanym czynnikiem zaangażowanym w kontrolę plastyczności, BDNF i zamierzamy m.in. sprawdzić, czy MMP-9 może aktywować BDNF na zewnątrz synapsy, poprzez częściowe trawienie jego formy latentnej i uwolnienie aktywnej. Proponowane badania powinny wnieść zupełnie nową wiedzę w kilku obszarach: (1) w dziedzinie poznania mechanizmów działania MMP-9 na poziomie synapsy, co może prowadzić do wykorzystania tej wiedzy w terapii chorób psychicznych; (2) w zakresie zrozumienia mechanizmów molekularnych plastyczności synaptycznej, dodając tutaj całkowicie nowy, zewnątrzkomórkowy wymiar regulacji tego zjawiska; (3) dla rozwoju funkcjonalnej konektomiki (odkrywania sieci połączeń i ich modyfikacji czynnościowej pod wpływem przetwarzania informacji), dostarczając i weryfikując nowe, potencjalnie bardzo atrakcyjne narzędzie badawcze w postaci znacznika fluorescencyjnego (aktywna MMP-9 i jej biosensor) synaps podlegających długotrwałym zmianom plastycznym.
Uzależnienie jest patologiczną formą bardzo trwałej pamięci, która uzurpuje sobie układ nagrody w mózgu i sprawia, że przyjmowanie narkotyku staje się najważniejszym celem w życiu. U podstaw tej choroby leży plastyczność synaptyczna – zdolność mózgu do przystosowywania się do otaczających bodźców, poprzez zmianę siły i liczby synaps. W moich badaniach skupiam się na kompleksie ciała migdałowatego – strukturze w mózgu, która przypisuje zdarzeniom wartość emocjonalną – zarówno pozytywną jak i negatywną (odpowiednio uczenie apetytywne i awersyjne). Badam mechanizmy plastyczności synaptycznej, które odróżnią tworzenie się pamięci o pozytywnych zdarzeniach od tej patologicznej, powodującej uzależnienie. Używając modeli zwierzęcych (uzależnienia od alkoholu i kokainy), elektrofizjologii metodą patch-clamp oraz mikroskopii konfokalnej badam ciało migdałowate aby zrozumieć które komórki ulegają zmianom plastycznym, oraz jaka jest natura tych zmian. Po spożyciu alkoholu, neurony centralnej części ciała migdałowatego tworzą tzw. ciche synapsy – niedojrzałe połączenia, które zwiększają w komórce potencjał do integracji nowych informacji. Śledząc powstawanie i późniejszy los cichych synaps w różnych modelach uzależnień dowiemy się jak rozwija się uzależnienie oraz co zrobić aby temu zapobiec.
Alkohol indukuje ciche synapsy w centralnej części ciała migdałowatego.
(A) Alkohol wywołuje zmiany plastyczne w neuronach ciała migdałowatego (B) Przykładowe prądy ilustrujące 5 kolejnych przebiegów aktywności receptorów AMPA i NMDA nagranych przy potencjałach -60 oraz +45mV, aby wyliczyć liczbę cichych synaps. Po 7-dniowej abstynencji (WD7), liczba AMPA-cichych synaps wzrosła, co reprezentuje większa liczba prądów receptorów NMDA przy braku prądów AMPA (ciemno-szare przebiegi). Skala: 20 pA, 20 ms. (C) Wykres podsumowujący liczbę cichych synaps – spożycie alkoholu oraz późniejsza abstynencja prowadzi do wzrostu cichych synaps w ciele migdałowatym.
Najczęstszą postacią padaczki u ludzi jest padaczka skroniowa charakteryzująca się nawracającymi napadami drgawkowymi powstającymi w obrębie płata skroniowego. Mimo, iż systematycznie pojawiają się nowe leki przeciwdrgawkowe, to u około 40% pacjentów choroba jest oporna na działanie dostępnych farmakoterapii. Z tego powodu nadal poszukuje się nowych metod terapeutycznych, a uwaga badaczy coraz częściej skupia się na ingerencji w proces epileptogenezy. Z reguły w epileptogenezie istnieje okres utajenia trwający do kilku miesięcy od jej rozpoczęcia, po którym dochodzi do stopniowego rozwoju padaczki klinicznej i towarzyszących jej nawracających drgawek. Ten krytyczny okres utajonego rozwoju choroby oferuje okno czasowe, w którym odpowiednio podjęte leczenie może zatrzymać proces powstawania padaczki.
W celu wyjaśnienia procesów zachodzących w mózgu wiele uwagi poświęcono komunikacji pomiędzy neuronami oraz zmianom jakim ta komunikacja podlega. W ciągu ostatnich lat stało się jednak jasne, że funkcje synaptyczne nie zależą wyłącznie od samych neuronów, ale są w znacznym stopniu regulowane przez komórki glejowe, a w szczególności astrocyty. Obserwacje te doprowadziły pod koniec lat 90. do stworzenia pojęcia "synapsy trójdzielnej", gdzie w skład połączenia nerwowego, oprócz części pre- i post-synaptycznej wchodzą również wypustki komórek glejowych. Obecny pogląd na fizjologiczną rolę astrocytów opiera się na tym, że oprócz zapewnienia homeostatycznej kontroli i wsparcia metabolicznego neuronów, odgrywają one aktywną rolę w przetwarzaniu informacji w obrębie układów nerwowych. Uważa się, że sygnalizacja Ca2+ reprezentuje pobudliwość astrocytów i pośredniczy w ich działaniach neuromodulacyjnych. Niemniej jednak lata sprzecznych wyników próbujących powiązać wewnątrzkomórkowe wzrosty Ca2+ uwalnianiem glioprzekaźników z astrocytów doprowadziły do dużych rozbieżności w obecnych modelach. Dodatkowo, nowe badania wykazały, że większość sygnałów Ca2+ w astrocytach jest krótka i lokalna, i rzadko dociera do ciała komórki. Dlatego też celem tego projektu jest przetestowanie hipotezy, że uwalnianie glioprzekaźników z astrocytów na drodze egzocytozy jest regulowane głównie przez lokalne sygnały Ca2+ z pominięciem magazynów Ca2+ w siateczce śródplazmatycznej.
Jednym z największych wyzwań współczesnej neuronauki jest zrozumienie podstawowych procesów zachodzących w mózgu, takich jak uczenie się i powstawanie wspomnień. Do tego konieczne jest opisanie struktury mózgu poprzez stworzenie mapy połączeń pomiędzy komórkami nerwowymi. W proponowanym projekcie chcemy skoncentrować się na obwodach neuronalnych zaangażowanych w powstawanie pozytywnych i negatywnych wspomnień, czyli w uczenie apetytywne i awersyjne. Skojarzenia z przyjemnymi doświadczeniami, jak otrzymanie pokarmu, oraz nieprzyjemnymi, wywołującymi strach, powodują powstawanie silnych wspomnień, co wywołuje wyraźne zmiany w mózgu. Istniejące prace wskazujące na obszary zaangażowane w te procesy (LeDoux 2000) najczęściej koncentrują się na konkretnych obszarach lub pojedynczych projekcjach, co nie wystarcza do stworzenia bardziej kompleksowej mapy obejmującej różne obszary mózgu jednocześnie. Do niedawna obrazowanie całego mózgu z komórkową rozdzielczością było możliwe tylko przez pokrojenie go na wiele cienkich skrawków i komputerową rekonstrukcję obrazu (Osten i Margrie 2013). Jednak ostatnie lata zaowocowały rozwojem technik obrazowania niedestruktywnego opartych na połączeniu oczyszczania mózgu tak, aby stał się przezroczysty dla światła, i obrazowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego opartego na arkuszu światła (ang. light-sheet fluorescence microscope, LSFM). Podejście to zademonstrowali po raz pierwszy Dodt i współpracownicy (Dodt i wsp. 2007). W kolejnych latach zaproponowane zostały inne metody oczyszczania, które lepiej zachowują fluorescencję i umożliwiają obrazowanie całego mózgu myszy (Chung i Deisseroth 2013; Susaki i wsp. 2014). Obrazowanie całego, oczyszczonego mózgu przy pomocy np. mikroskopu konfokalnego jest możliwe, lecz niepraktyczne ze względu na długi czas obrazowania (rzędu tygodni) (Chung i Deisseroth 2013). W mikroskopii opartej na arkuszu światła obraz jest zbierany nie punkt po punkcie, lecz płaszczyzna po płaszczyźnie, co znacznie skraca czas pomiaru. Dlatego metoda ta idealnie nadaje się do obrazowania dużych preparatów, takich jak całe oczyszczone mózgi, z submikrometrową rozdzielczością (Tomer i wsp. 2014).
Przekrój przez mózg szczura Thy1GFP NeuN (czerwony), Thy1GFP transgen (zielony)
Mysz w rogu klatki IntelliCage
Mysz w rogu klatki IntelliCage
Aktywność żelatynolityczna na kolcach dendrytycznych neuronów hipokampa
Jądro podstawno-boczne mózgu myszy transgenicznej. GAD67+ (zielony), jądra komórkowe (niebieski)
Gigaseal – neuron w trakcie doświadczenia elektrofizjologicznego
Mikroskop arkusza światła
Komora do obrazowania mikroskopu arkusza światła
Przekrój mózgu myszy transgenicznej GAD67 z podanym wektorem AAV, który koduje kanałorodopsynę (zielony). Neurony GAD67+ (czerwony)
BRAINCITY
